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公子小丑鱼（Amphiprionocellaris）胚胎发育的形态学观察及盐度对幼鱼生长的影响

摘  要

公子小丑鱼，学名为眼斑双锯鱼，海葵鱼属(Amphiprion)，雀鲷科(Pomacentri- dae)，鲈形目（Perciformes）。公子小丑鱼是最常见的海洋观赏鱼类，雌雄同体，雄性先熟，分布于西太平洋礁岩海域。公子小丑鱼以其鲜艳的色彩、漂亮的花纹及可爱的形象而深受水族爱好者的喜爱。

挑选合适的野生的公子小丑鱼个体在实验室条件下进行配对，调控适宜的外界环境因子并进行营养强化使其产卵，产卵以后进行人工孵化。仔鱼在孵出的第2d即开口食用由小球藻(Chlorellasp)强化的褶皱臂尾轮虫(Brachionusplicatilis),全长4.2～4.4mm,为仔鱼期，4～6d变态为稚鱼,全长5.1～5.4mm;开始投喂刚孵出的卤虫无节幼体,10d以后开始投喂经小球藻强化的卤虫(Artemiasp)，16～22d 进入幼鱼期,全长10.0～12.4 mm，35～45d开始投喂自制人工配合饵料。

    在实验室水温26±1℃、盐度28±1的条件下，对公子小丑鱼胚胎发育过程中的形态学变化进行了观察研究。结果表明，公子小丑鱼受精卵属附着性卵，呈长椭圆形,长径2.0mm±0.1mm，短径0.95mm±0.1mm；其卵裂方式为端黄卵盘状卵裂；胚胎发育可分为10个主要阶段：卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、体节期、翻转期、血管形成期、器官形成期和孵化期。发育过程中胚胎的颜色逐渐加深，呈现由橙黄色到棕黄色的变化；在26℃水温条件下，整个胚胎发育过程需200h左右。

在水温26±1℃的条件下,研究了盐度对公子小丑鱼幼鱼生长、摄食、饵料利用率和生长激素及其受体mRNA水平的影响。第42d和70d的试验结果都表明, 公子小丑鱼幼鱼在各盐度实验组成活率无显著差异; 当盐度为25和30时生长最快,盐度20时次之,盐度15和35时较慢;与之相应的饵料转换效率也是在盐度25和30时最高,盐度20、35、15依次降低;相对体重增长率也是在盐度25和30时最高,盐度20、35、15依次降低。第70d时取样进行分子生物学实验，结果表明，公子小丑鱼脑垂体GHmRNA水平在盐度15时最高，盐度25次之，盐度20、30、35时较低;肝脏GHR1mRNA水平在盐度20、25、30时最高，盐度35次之，盐度15时最低;肝脏GHR2mRNA水平在盐度25时最高，盐度20时次之，盐度30、35、15时较低。公子小丑鱼幼鱼GHR1和GHR2mRNA表达量与其生长呈正相关。说明公子小丑鱼幼鱼最适宜的生长盐度为25到30。

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目  录
摘  要        I
ABSTACTS        III
引  言        1
1. 小丑鱼分布和生活习性        1
2. 交配产卵        3
3. 人工繁殖、胚胎发育和环境因子对仔幼鱼的影响        3
4.荧光定量方法        4
5.繁殖生产中存在的问题        5
第一章  公子小丑鱼养殖模式和人工繁殖        6
1 材料与方法        6
1.1亲鱼养殖模式        6
1.1.1 亲鱼养殖系统        6
1.1.2 亲鱼的来源        7
1.1.3 亲鱼的暂养        7
1.1.4 亲鱼的配对        7
1.1.5 亲鱼的培养        7
1.2幼体培育系统        7
1.3 培育用水        8
1.4 生物饵料培养        8
1.5 仔幼鱼对饵料的需求        8
2.1 亲鱼产卵        8
2.2  受精卵人工孵化        9
2.3 仔幼鱼的孵化率和成活率        10
3讨论        10
第二章 公子小丑鱼胚胎发育的形态学观察        13
1 材料与方法        13
1.1  实验用鱼和养殖管理        13
1.2  胚胎发育观察        13
2 结果与分析        14
2.1 卵裂前期        15
2.2 卵裂期（1h）        16
2.3 囊胚期（5h）        16
2.4 原肠期（10h）        16
2.5 神经胚期（20h）        20
2.6 体节期（22h）        20
2.7 翻转期（35h）        20
2.8 血管形成期（56h）        21
2.9 器官形成期（72h）        21
2.10 孵化期（199h）        21
3 讨论        22
3.1 胚胎发育过程        22
3.2 孵化时间        22
3.3 胚胎颜色的变化        23
第三章 盐度对公子小丑鱼幼鱼生长和生长激素及其受体mRNA水平的影响        24
1 材料与方法        24
1.1 实验材料        24
1.2 实验方法        24
1.2.1 生长、成活率、摄食实验        24
1.2.2 生长激素及其受体mRNA水平实验        25
1.2.2.1  总RNA的提取        25
1.2.2.2  反转录及引物设计        25
1.2.2.3  常规PCR        26
1.2.2.4  荧光定量PCR 扩增        26
1.3 数据分析        26
2 结果        27
2.1  不同盐度对公子小丑鱼幼鱼成活率的影响        27
2.2 不同盐度对公子小丑鱼幼鱼生长及摄食的影响        27
2.3 荧光定量PCR分析        31
2.4  公子小丑鱼生长激素及其受体mRNA基因与β-actin mRNA 基因的荧光定量PCR标准曲线        33
2.5各盐度组垂体GHmRNA相对表达量        35
3 讨论        36
3.1盐度变化对公子小丑鱼幼鱼存活与生长的影响        36
3.2 盐度变化对公子小丑鱼幼鱼生长激素及其受体mRNA水平的影响        36
小  结        38
参考文献        39
攻读硕士期间发表的论文        43
致  谢        44

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引  言
公子小丑，海葵鱼属(Amphiprion)，雀鲷科(Pomacentridae)，鲈形目（Perciformes）。分布于中国南海、菲律宾、西太平洋的礁岩海域。性成熟后雌鱼体形比雄鱼大。野生雌性成体体长10-12cm，人工水族缸养殖体长多不大于10cm。体色橘红，椭圆形，体侧有三条银白色环带，分别位于眼睛后、背鳍中央、尾柄处，其中背鳍中央的白带在体侧形成三角形，各鳍橘红色有黑色边缘，喜欢躲在海葵中。公子小丑鱼由于其鲜艳的色彩、漂亮的花纹及可爱的形象而深受水族爱好者的喜爱。从1997到2002，公子小丑鱼占据了世界观赏鱼类鱼类总出口量15.6%和欧洲国家进口份额的25%以上[1]。海水观赏鱼也占到美国渔业贸易出口总额的20%，价值约8.9亿美元（Johunstou）[2]。迪士尼动画大片《海底总动员》的热播更是让公子小丑鱼“尼莫”成为家喻户晓的明星，也使其销量增加了两倍。随着经济的飞速发展和人民对精神文化需求的提高，海水水族缸在2000年后开始在国内兴起并飞速发展，目前在国内大中城市，海水观赏鱼店如雨后春笋般出现。
     由于受人工繁殖技术和生产规模的局限，目前市场上销售的公子小丑鱼仍以捕捞野生自然群体为主，并多用氰化物等有毒化学品进行捕捞，采捕后由于氰化物的毒性和长途运输中的氨中毒，能够作为商品进入市场的不足20%[3]，而且氰化物还会伤害无法逃避的珊瑚等海洋生物，破坏珊瑚礁区的生态平衡，所以海水观赏鱼的大规模商业化人工繁育就变得势在必行。目前国内外已有不少学者对公子小丑鱼的生理生态、繁殖发育做了初步研究[4-7]，并成功进行了人工育苗和批量化生产，但规模仍较小，满足不了市场所需。
1. 小丑鱼分布和生活习性
小丑鱼是对雀鲷科海葵鱼亚科鱼类的俗称，是一种热带海洋鱼类。已知有28种，一种来自棘颊雀鲷属（Premnas），其余来自双锯鱼属（Amphiprion）。小丑鱼与海葵有着密不可分的共生关系，因此又称海葵鱼。带毒刺的海葵保护小丑鱼，小丑鱼则吃海葵消化后的残渣，形成一种互利共生的关系。
（1）形态特征：背棘(总数)，12 - 12；背的软条 (总数)，14 - 16；臀棘 2；臀鳍软条，14–15，稚鱼全体是黑色的；前额与上侧面上有白色的斑块；所有鳍的外缘都是黑色。成鱼的地理分布和颜色是可变的。见图1

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图1  公子小丑鱼
Fig.1 Amphiprion ocellaris
（2）生态习性及食性：栖息于珊瑚礁与岩礁，常与大的海葵，海胆或小的珊瑚顶部共生。形成小群到大群鱼群。胃内含物包括藻类，桡足类及其他的浮游性甲壳动物。
（3）常见种类：
公子小丑：分布于中国南海、菲律宾、西太平洋的礁岩海域，属雀鲷科，体长10-12cm，椭圆形。体色橘红，体侧有三条银白色环带，分别位于眼睛后、背鳍中央、尾柄处，其中背鳍中央的白带在体侧形成三角形，各鳍橘红色有黑色边缘。
红小丑：Amphiprion frenatus，地理分布 分布在西太平洋的珊瑚礁海域，分布范围包括泰国湾至帕劳群岛西南部，北至日本南部，南至印度尼西亚的爪哇一带海域。成鱼体呈椭圆形而侧扁，吻短而钝。眼中大，上侧位。口大，上颌骨末端不及眼前缘；齿单列，齿端具缺刻。背鳍单一，软条部延长而呈方形；尾鳍呈扇形，上下叶外侧鳍条不延长呈丝状。成鱼体黑色，头部、胸腹部以及身体各鳍均为红色。眼睛后方具一镶白缘之宽白带，向下延伸至喉峡部。亚成鱼体一致橙黄色，眼睛后方具一白色竖带。随着成长，体色逐渐转红，且身体后方出现黑斑并扩散至整个身体。
透红小丑鱼：Premnas biaculeatus，分布于印度洋、太平洋的珊瑚礁海域，属雀鲷科，体长10-15cm，椭圆形。全身紫黑色，各鳍紫红色，体侧在眼睛后、背鳍中间、尾柄处有三条银白色环带。
小丑鱼也通常被叫为海葵鱼,与特定的海葵组成一种互利共生的关系。一个大的海葵（直径为一米）可以庇护多达30多个各种大小的小丑鱼。所有的小丑鱼都是雄性先熟的雌雄同体鱼，开始是雄性后来变为雌性。与其它雀鲷科鱼类的成对关系不一样的是，大部分小丑鱼种类都是永久的一夫一妻制。雌雄的结合非常紧密直到其中的一个成员消失时才会被打破。在大部分情况下，雌性的死亡更普遍，因为雌性一般是最大和最老的个体，当一个小丑鱼家族的的雌鱼死亡后，雄鱼会转化为雌鱼，与此同时优势的未成熟的雄鱼就会转化为成熟的雄鱼，这个过程通常需要几个月到一年才能彻底完成，而且这个过程是不可逆的[8,9]。小丑鱼在深海产卵，把单层的卵产到坚硬的基面上。
在自然环境中，海葵会警戒着卵使之不受外界侵扰，因为卵在海葵的管辖范围之内。亲鱼通常都照顾受精卵直到幼鱼孵出。用鳍条扇动的行为使围绕在巢穴的水富含氧气，同时用嘴去除受损和坏掉的卵以保证健康的卵不被污染[10]。

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2. 交配产卵
公子小丑鱼典型的产卵信号是亲鱼在产卵前约3-4小时清洁陶罐内部的污点。在此期间，雌性的产卵器，一个白色的小管，从肛门附近的微孔延伸出来。根据对于小丑鱼的产卵观察，透红小丑鱼一般在上午十一点左右产卵，而公子小丑一般在下午产卵，时间不定。雄鱼积极的参与瓦罐的清洁工作而雌鱼在产卵前0.5-1h更积极参与瓦罐的清理。
在第一批10到20个卵被产出后，雌鱼将在产下下一批卵之前仔细检查这批卵。这些卵被产在陶罐的内壁并呈圆形排列。雌鱼产卵后，雄鱼肛门孔扩大对卵进行受精。雄鱼在卵上游动并用生殖器触碰卵。这种行为在鱼进行下一组鱼产卵前通常重复2-3次。
刚产的卵为橙黄色，长椭圆形(2.0×1.0mm),而且在卵黄的中部成轻微的弧形。卵可以通过外壳看到因为卵膜是透明的。卵黄呈鲜亮的橙色，同时油滴清晰可见。

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3. 人工繁殖、胚胎发育和环境因子对仔幼鱼的影响
目前对于海水观赏鱼的专业性研究相对较少，主要集中在生活习性[11,12]、分布[13,14]、分类、生理、人工繁殖与发育等的研究。能够实现人工繁殖的也仅限于虾虎科、拟雀鲷科和雀鲷科的几个品种，虾虎科有金灯虾虎（Elacatinus sp）、蓝灯虾虎（Elacatinus oceanops）[15]等，拟雀鲷科有美国草莓（Pseudochromis fridmani）[16]、蓝线（Pseudochromis springeri）、日出龙（Pseudochromis flavivertex）[17]等，雀鲷科主要就集中在小丑鱼身上，小丑鱼是对雀鲷科海葵鱼亚科鱼类的俗称，已发现的小丑鱼约有28种，目前报道能够人工繁育的有十几种。
虽然在海水水族缸里人工养殖小丑鱼历史已有几十年, 而且早在1978年Ross就研究了黑红小丑(Amphiprion melanopus)的繁殖习性[18]，但对小丑鱼进行人工繁殖和发育的相关研究主要在近十年。2000年M.Arvedlund等研究了黑红小丑的光周期对黑红小丑(A.melanopus)仔稚鱼生长的影响[19]，2001年Ignatius等研究了一种黑双带小丑（A.sebae）的人工繁育技术[20]，2002年Madhu报道了黑边公子小丑(A.percula)的人工繁殖[21]，2004年Bridget报道了黑红小丑(A.melanopus)胚胎发育和耗氧量之间的关系[22]，2005年Ho描述了银边小丑(A.perideraion)亲鱼的繁殖行为以及胚胎发育及幼体培养[23]；Sukjai描述了鞍背小丑(A polymnus)的胚胎发育[24]；滕力平等简述了二线小丑的人工繁殖和胚胎发育[25]；Aratake先后研究了将红双带小丑(A.clarkii)暂养在日本九州岛的西、南两个海域中产卵卵径及数量的季节性变化和卵径与蕴含能量之间的关系[26,27]，2006年L J LIEW和何兴源分别报道了公子小丑实验室条件下的胚胎发育和生殖行为与育苗[5,6]，2007年Yasir报道了公子小丑鱼(A．ocellaris)繁殖习性及胚胎和仔鱼的发育[4]，2008年鲍鹰等先后对红小丑(A.frenatus)人工育苗与胚胎发育和透红小丑（P biaculeatus）人工繁殖与育苗进行了初步的研究[28,29]，2009年K V Dhaneesh描述了黑边小丑(A percula)的胚胎发育[30]，2010年王斌对公子小丑鱼的人工繁育技术进行了初步的研究[7]，2011年Ye Le等报道了温度对红双带小丑(A.clarkii)幼鱼成活率、发育、生长的影响[31]，2012年K.V.Dhaneesh等报道了线小丑(A akallopisos)的繁殖、胚胎发育和耐盐性[32]。
综上所述，十年来对于小丑鱼繁殖与发育的研究呈井喷之势，国内对于小丑鱼的研究也开始逐渐增多，随着对小丑鱼发育和繁殖机理的研究不断深入，相信小丑鱼的大规模商业化必将成为现实。

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4.荧光定量方法
实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术由美国Applied Biosystems 公司推出，它实现了PCR从定性到定量的飞跃。荧光定量PCR 具有特异性强，无污染，自动化程度高等优点，广泛应用于不同的研究领域。
实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术是指在普通的PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR过程，最后通过构建标准曲线和目的及内参基因达到荧光阈值的CT值对未知模板进行定量分析。荧光化学材料可分为荧光染料和荧光探针两类。荧光染料主要以SYBR GreenⅠ为主要代表，是非特异性荧光化学材料。SYBR Green 是荧光定量常用的染料，SYBR Green可以与扩增过程中形成的双链DNA结合并且发出荧光。在游离的状态下，SYBR Green只能发出非常微弱的荧光，但是SYBR Green与双链DNA结合之后，荧光的强度就可以增强到其在游离状态的1000倍以上。所以一个PCR反应中检测到的全部荧光信号与扩增得到的双链DNA量的是成正比例关系的，我们也就可以通过检测荧光信号计算出出PCR体系中扩增出来的的双链DNA的量。

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5.繁殖生产中存在的问题
首先是人工配对的问题，亲鱼如和配对，如何挑选亲鱼，其次是配对后使用什么饵料才能促使亲鱼成熟并产卵，产卵后胚胎发育所需要的条件，如何人工孵化，孵化后幼鱼生长的最佳条件，比如用什么饵料、盐度、温度、光照、pH、溶氧、氨氮亚硝酸盐、海水中镁离子与钙离子的比例与含量等等还研究很少，并没有产生完整的操作规范。小丑鱼是雄性先熟的雌雄同体鱼，在生长过程中可能会经历由雄性向雌性的性逆转，性逆转的过程中主要由什么基因控制，也研究不多。
本文的介绍了公子小丑鱼亲鱼的养殖模式及人工繁殖，观察了胚胎发育的形态学变化，并研究了盐度对公子小丑鱼幼鱼生长、摄食、饵料利用率和生长激素及其受体mRNA水平的影响，以期为公子小丑鱼和其它海水观赏鱼的大规模人工繁殖提供更多的理论依据。

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第一章  公子小丑鱼养殖模式和人工繁殖

1 材料与方法
1.1亲鱼养殖模式
1.1.1 亲鱼养殖系统
    亲鱼培育系统共有上下四个玻璃缸，下面一个为过滤缸（80×80×60cm）。上面三个为养殖缸（80×50×40cm）。最上面一个养殖缸养羽毛藻来调控水质，中间两个养殖缸每个隔为三格，每格放入一个产卵罐供亲鱼产卵。

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  1.1.2 亲鱼的来源
    第一批亲鱼购自浙江海水养殖研究所，以后的几批均购自广州花地湾水族市场，其来源为菲律宾和印尼的珊瑚礁海域。
1.1.3 亲鱼的暂养
   盐度为25-30，养殖水温为28℃±1℃，pH为8.0-8.1，光照2500-5000lx，NH3-N水平低于0.5mg/L,NO2-N水平低于0.15 mg/L，NO3-N水平低于25mg/L。
1.1.4 亲鱼的配对
   选择体长在8cm以上的作为雌鱼，体长7cm以下的较大个体为雄鱼。雌雄比例可以按1:1,1:2,1:N等。
  1.1.5 亲鱼的培养
   控制亲鱼养殖水温为26℃±1℃，pH为8.0-8.1，盐度为27-29，光照2500 -5000lx，NH3-N水平低于0.5mg/L,NO2-N水平低于0.15 mg/L，NO3-N水平低于50mg/L。水温通过水系统中加热棒控制。每天下午用虹吸管吸出缸底剩饵，及时补充因虹吸损失的水，每三天检测并调整一次盐度。在水系统中适量培养羽毛藻等水生植物来调控改善水质。每天投喂由鲜虾肉，鱿鱼，蛏子，冰冻卤虫，冰冻红虫，螺旋藻等混合而成的自制配合饵料。分别于上午10:00和下午4:00投喂2次。